陈振艳，张相琴，陈兰，谢思艺，刘硕谦,2*，田娜,2*
茶树基因家族的鉴定及表达分析
陈振艳1，张相琴1，陈兰1，谢思艺1，刘硕谦1,2*，田娜1,2*
1. 湖南农业大学园艺学院茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；
2. 湖南农业大学园艺学院茶学系，湖南 长沙 410128
NUDIX水解酶属于焦磷酸酶，在信息传递、植物生长协调和响应逆境胁迫等方面起着重要作用。基于茶树（）基因组鉴定出43个家族基因，并运用生物信息学和实时荧光定量PCR等方法对其分析。结果表明，43个CsNUDXs蛋白质分子量介于11.8～89.2 kDa，氨基酸长度为102～342个，理论等电点为4.49～9.26，18.6%的蛋白为稳定性蛋白；
根据进化关系将分为6个亚家族；
启动子顺式作用元件分析发现具有许多与激素响应、逆境胁迫和生长发育等调控相关的作用元件；
对家族基因在不同器官表达模式进行分析，发现、在果实中表达量较高，而、在果实中表达量极低，在老叶中表达量极低；
不同处理组的实时荧光定量PCR结果表明，1 mmol·L-1茉莉酸甲酯（MeJA）处理下、和等表达量呈现先升后降再升的趋势，而1 mmol·L-1水杨酸（SA）处理下、和等表达量则呈现先降后升再降的趋势，300 mmol·L-1NaCl处理下和等表达量呈现先升后降的趋势。本研究应用生物信息学技术初步解析了的基本特征和功能，发现可响应高盐胁迫和MeJA、SA处理。
茶树；
基因家族；
非生物胁迫；
表达分析
NUDIX水解酶（Nucleoside diphosphate linked to x hydrolases）是一类能够催化水解核苷糖、二核苷多聚磷酸盐和三磷酸核苷等多类有机焦磷酸盐的焦磷酸酶[1]，广泛分布在生物体内。大肠杆菌中MutT（NudA）是最早被发现的NUDIX水解酶，故NUDIX水解酶家族又被称为MutT家族[2]。该家族特征是具有一段高度保守的氨基酸序列——GX5EX7REUXEEXGU（其中U表示疏水基团，X表示任意氨基酸），当其核心序列REUXEEX中的谷氨酰胺残基与二价阳离子结合时，NUDIX蛋白发挥作用[2-3]。
NUDIX水解酶在植物逆境胁迫响应过程中发挥着重要作用。干旱胁迫下，过表达山桃（）可提高、和等抗性基因的表达，有效减少烟草的干旱损伤[4]；
敲除拟南芥（）中的基因会降低其抗氧化胁迫能力[5]，当被沉默后会诱导防御相关基因的表达，并提高植物对丁香假胞菌的抗性[6]；
过表达可维持植物体内正常的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）和腺苷三磷酸（Adenosine triphosphate，ATP）含量，增强植物抗氧化胁迫的能力[5,7]。此外，NUDIX水解酶也广泛参与了植物激素信号的转导过程。对山桃苗进行脱落酸（Abscisicacid，ABA）处理后，会受到明显诱导，且转基因烟草中的和等ABA信号通路中关键基因的转录水平明显高于野生型（WT），而的转录水平明显低于WT，表明可调控ABA信号转导通路[4]；
是NPR1依水杨酸（Salicylic acid，SA）信号通路的阳性调节因子，敲除或过表达会使参与SA诱导NPR1激活过程中相关基因和的表达量增加或降低[4,8]；
与野生型相比，和基因共缺失型拟南芥的差异基因对茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）的响应显著[9]。目前，家族已经在拟南芥[10]、陆地棉（）[11]、桃树（）[4]、玫瑰（）[12]、甘菊（）[13]、大豆（）[14]和葡萄（）[15]等植物中被鉴定，其在拟南芥中响应植物激素和逆境胁迫的作用机制已逐渐被揭开，但在茶树中的研究尚浅[16]。
因此本研究基于茶树基因组数据库，对茶树家族基因进行全基因组鉴定，并分析茶树基因家族成员在不同器官及高盐胁迫和激素处理（MeJA和SA）下的表达模式，为进一步探究家族基因在茶树中的作用奠定基础。
1.1 试验材料
以碧香早茶树枝梢为试验材料，采自湖南农业大学茶叶研究所茶园（113° E，28° N）。
高盐处理：将长势一致且生长状况良好的茶树枝梢插入300 mmol·L-1NaCl溶液中。激素处理：向茶树枝梢分别喷洒1 mmol·L-1MeJA溶液和1 mmol·L-1SA溶液，以液体布满叶片为标准；
并将插入ddH2O中的茶树枝梢作为对照。将以上处理材料放入温度为(25±2)℃、相对湿度为70%～75%、光照周期为14 h光/10 h暗的气候室中进行培养。在处理0、3、9、24 h和48 h后随机摘取3～5片嫩叶，取样后进行液氮冷冻固样，置于–80 ℃保存备用，每个处理3次生物学重复。
1.2 试验方法
1.2.1基因家族的筛选
从茶树基因组数据库（http://teaplant.org/index.html）中下载茶树的全基因组数据，从拟南芥基因组数据库（https://www. arabidopsis.org）中下载拟南芥NUDIX蛋白序列，用于后续分析。以拟南芥的25个NUDIX蛋白序列为参考，在茶树基因组数据库中进行BlastP比对，设定阈值E<1E-6，获得潜在的基因家族序列；
从PFAM（http://pfam. xfam.org）数据库中下载NUDIX基因特有的保守结构域模型（PF00293），并通过HMMER 3.0软件中的hmmersearch搜索鉴定含有NUDIX保守结构域的茶树蛋白序列。合并已获得的两个推定的蛋白序列文件，提交至SMART（http://smart.embl-heidelberg.de）、PFAM和NCBI-CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）等网站进行验证，整理并剔除冗余序列，获得最终的茶树NUDIX基因家族成员。
1.2.2 CsNUDXs蛋白理化性质及亚细胞定位预测
利用ExPASy Compute pI/Mw（http://web. expasy.org/compute_pi）对NUDIX蛋白的理化性质进行分析，用WoLF PSORT（https://wolfpsort. hgc.jp）工具预测蛋白质亚细胞定位。
1.2.3系统发育关系、基因结构和基序分析
通过MEGA 7.0软件对茶树和拟南芥的NUDIX蛋白序列进行多序列比对，并采用邻近连接法（Neighbour-joining method）构建系统进化树，校验参数设置为1 000次[17]。将家族基因的编码序列（Coding sequence，CDS）提交至MEME网站（https:// meme-suite.org）进行基因基序分析，基序数目设置为10个，氨基酸长度设置为6～55个，其余参数为默认。通过TBtools[18]软件进行可视化分析。
1.2.4染色体定位和启动子顺式元件分析
利用HMMER 3.0软件中的perl脚本从茶树基因组注释信息中获取在染色体上的起始位置，并通过MG2C（http://mg2c. iask.in/mg2c_v2.1）进行可视化。运用TBtools软件提取上游2 000 bp的序列，通过PlantCare（http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare）网站进行启动子顺式作用元件预测，并通过TBtools[18]软件进行可视化。
1.2.5表达模式分析
从茶树基因组数据库中下载茶树8个不同器官（顶芽、嫩叶、成熟叶、老叶、茎、根、花和果实）中的表达量数据，筛选高表达的家族成员，并通过TBtools[18]软件进行可视化。
1.2.6 实时荧光定量PCR分析
利用FastPure®Universal Plant Total RNA Isolation Kit（诺唯赞，南京）分别提取对照组和3个处理组（NaCl、MeJA和SA）的茶树嫩叶总RNA，并通过超微量紫外分光光度计（赛默飞，美国）和1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性、纯度和浓度。使用Fastking gDNA Dispelling RT SuperMix Kit（天根，北京）将RNA反转录为cDNA。
2.1 CsNUDXs基因家族的筛选及理化性质
从茶树基因组中共鉴定到43个基因，根据其在染色体上的位置进行命名，并进一步对其编码的蛋白质进行理化性质分析。结果表明，茶树NUDIX含有氨基酸残基为102～342个；
分子量为11.8～89.2 kDa；
脂肪族指数为50.67～103.67；
理论等电点（pI）介于4.49～9.26，其中pI＜7的CsNUDXs蛋白达到70%以上。43个CsNUDXs蛋白中仅有CsNUDX1、CsNUDX3、CsNUDX6、CsNUDX10、CsNUDX21、CsNUDX22、CsNUDX30和CsNUDX31的不稳定指数低于40，其余均为不稳定蛋白。除CsNUDX36和CsNUDX29外，其余CsNUDIXs蛋白均为亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果显示（表2），主要分布在细胞核、叶绿体、线粒体中。
2.2 CsNUDXs系统进化
将茶树和拟南芥的基因家族成员构建系统发育进化树。结果表明（图1），茶树基因家族可分为6个亚家族，分别含有10、3、10、8、3个和9个。其中（CSS0008608.1）和（CSS0042662.1）、（CSS0021705.1）和（CSS0015340.1）等26个基因在进化树上分别成对出现，说明它们进化关系较近；
（CSS0000911.1）、（CSS0028900.1）、（CSS0035220.1）、（CSS0026873.1）和（CSS0026618.1）等5个与进化关系较近。
表1 CsNUDXs表达分析的实时荧光定量PCR引物
表2 CsNUDXs的亚细胞定位
2.3 CsNUDXs结构和基序分析
对43个的保守基序进行分析，共鉴定出10个保守基序，依次命名为motif 1 ～motif 10（图2）。所包含的基序数量介于1～6，其中motif 1出现最频繁，其次是motif 10、motif 7和motif 6。均含有motif 1，motif 10为亚家族Ⅰ和亚家族Ⅵ共有；
此外，motif 2、motif 5和motif 8仅存在于亚家族Ⅲ中，motif 3、motif 4和motif 9仅存在于亚家族Ⅵ中。
对6个亚家族的的结构分析发现（图3），亚家族Ⅰ中内含子数目为1～7，其中和内含子数目最多，为7个；
亚家族Ⅱ中的含有20个内含子，和各有5个内含子；
亚家族Ⅲ中除（4个内含子）和（5个内含子）外，其余基因均有3个内含子；
亚家族Ⅳ的内含子数目为3～5，、和均有3个内含子；
亚家族Ⅴ中和有7个内含子，仅有4个内含子；
亚家族Ⅵ的内含子数目为5～8。综上所述，各亚家族中内含子数量差异较大，但同一亚家族中内含子个数相同的基因结构更为相似。
2.4 CsNUDXs染色体分布和启动子顺式作用元件分析
染色体分布结果显示（图4），有39个不均匀的分布在Chr1、Chr2、Chr4、Chr5、Chr6、Chr7、Chr8、Chr10、Chr12、Chr14和Chr15号染色体上。其中Chr12号染色体有6个，Chr6和Chr8号染色体各有5个，Chr1、Chr2、Chr5和Chr7号染色体各有4个，Chr14号染色体有3个，Chr10号染色体有2个，Chr4和Chr15号染色体各有1个；
、、、这4个基因未定位在染色体上。
图1 茶树和拟南芥NUDIX基因家族的系统进化树
图2 茶树NUDIX基因的motif分析
图3 茶树NUDIX基因结构分析
对上游2 000 bp的启动子区域进行顺式作用元件分析，结果显示（图5），除了含有基础的作用元件外（如和转录相关的TATA-box、CAAT-box等），还含有与光响应、激素响应、逆境胁迫和生长发育调控等相关的顺式作用元件。
2.5 CsNUDXs在茶树不同器官的表达分析
在不同器官表达模式分析结果显示（图6），在顶芽中表达量较高的基因有和，嫩叶中表达量较高的基因有、和，成熟叶中表达量较高的基因有、、和，老叶中表达量较高的基因有和，茎中表达量较高的基因有、和，根中表达量较高的基因有、、和等，花中表达量较高的基因有、和，、和在果实中表达量较高；
此外，和在果实中表达量极低，在老叶中表达量极低，这表明在茶树不同器官中具有表达特异性。
图4 茶树NUDIX基因在茶树染色体上的定位
注：A表示光响应，B表示脱落酸响应，C表示损伤响应，D表示低温响应，E表示赤霉素响应，F表示胚乳特异性负表达，G表示水杨酸响应，H表示干旱反应，I表示激素响应，J表示类黄酮合成基因调控，K表示玉米醇溶蛋白代谢调节，L表示种子特异性调节，M表示分生组织表达，N表示逆境胁迫，O表示缺氧反应，P表示厌氧反应，Q表示茉莉酸甲酯响应
2.6 CsNUDXs在MeJA、SA及NaCl处理下的表达模式
筛选出、、和等9个在茶树不同器官中表达量较高且含有大量与激素响应或非生物胁迫相关元件的基因做进一步的验证。
由图7可知，在MeJA处理下，、、和的表达量较高，的表达量持续上升，其余基因在处理后的表达量均呈先上升后下降再上升的趋势。
在SA处理下（图8），和的表达量在0～9 h下降，9～24 h上升，然后继续呈下降趋势；
和的表达量在处理0～3 h后下降，3～24 h上升，然后呈下降趋势；
和的表达量在处理0～3 h上升，3～9 h下降，9～24 h上升，然后继续下降趋势，其中表达量较高。
在NaCl处理下（图9），和的表达量较高。其中，和的表达量在处理后0～3 h增加，之后呈下降趋势；
的表达量在处理后0～3 h和9～24 h上升，3～9 h和24 h之后呈下降趋势；
在处理后0～3 h增加，3～9 h下降，之后呈上升趋势。
NUDIX水解酶可以降解植物体内积累过多的有害代谢物，在信息传递、生长协调和机体保护等方面起着重要作用[20]。本研究基于茶树全基因组数据共鉴定出43个茶树基因。在分析43个茶树基因保守基序时发现，每个基因中包含的基序数量在1～6，且进化关系较近的在基序的种类和长度上都较相似，这可能是由于同一亚家族的基因在功能选择和长期进化下形成的[21]；
其中，motif 1为各共有，表明它可能承担着重要且相似的功能；
motif 10为亚家族Ⅰ和亚家族Ⅵ共有，推测亚家族Ⅰ和亚家族Ⅵ的行使的功能可能有交叉。真核生物基因组的复杂程度与内含子数量有关[22]，基因间内含子数目差异易导致形成不同的可变剪切体，基因组中的可变剪切体可增强茶树对非生物胁迫的抗逆能力[23]；
本研究发现大部分家族基因的内含子数目介于1～20，且6个亚家族间存在差异（Ⅰ类：1～7，Ⅱ类：5～20，Ⅲ、Ⅳ类：3～5，Ⅴ类：4～7，Ⅵ类：5～8），家族基因的内含子数目差异可能导致形成不同的可变剪切体进而增强茶树的抗逆能力。在盐胁迫环境中，过量的Na+取代植物生长必需的K+，且Na+、Cl-与蛋白质或氨基酸结合时会降低蛋白质或氨基酸的活性，盐胁迫引起的渗透胁迫和营养不协调进一步引起氧化胁迫，使植物的光合作用和呼吸作用的电子链发生断裂，最终导致植物死亡[24]。研究发现，甘菊在NaCl浇灌处理后，在0～48 h的表达量先上升后下降，表明可响应盐胁迫，可能通过降低超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性[25]、增加过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性以提升甘菊清除活性氧的能力，进而提升了甘菊适应盐胁迫的能力[13]。茶树在响应盐胁迫时，表达量也呈先升后降的趋势，因此推测可能通过清除茶树体内的活性氧参与了茶树响应盐胁迫的过程。
注：AB表示顶芽，YL表示嫩叶，ML表示成熟叶，OL表示老叶，S表示茎，R表示根，FL表示花，FR表示果实
注：不同大、小写字母分别表示在0.01和0.05水平差异显著，下同
本研究还发现，在启动子区富含激素响应相关的作用元件，表明可能通过多个顺式作用元件参与茶树对激素的响应过程。在SA处理下呈现先上升后下降的表达趋势，敲除或者过表达会使得参与到SA诱导NPR1激活过程中的相关基因和的表达量上升或下降，表明可正向调节SA诱导NPR1激活过程进而影响植物免疫反应[8]；
甘菊的表达量在SA的诱导下也先上升后下降[13]。本研究发现和的表达量在SA处理后也呈现出先上升后下降的趋势，这与和表达模式相同，说明和可能通过正向调节SA诱导NPR1激活过程参与茶树对SA的响应。MeJA是植物体内重要的脂类衍生化合物，可作为信号分子和生长调节物质参与到植物的生长发育和对逆境胁迫的响应等过程[26]。MeJA可通过加深植物因盐胁迫导致的生长抑制，降低6-苄氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）和赤霉素（Gibberellin，GA）等植物激素的转录水平，使植株能更有效地进行离子稳态、渗透调节和抗氧化防御等反应[27]。本研究发现，在MeJA处理下大部分的表达模式有差异，表明响应MeJA刺激的作用机制不同。
图8 外源SA处理下部分CsNUDXs的相对表达量
图9 外源NaCl处理下部分CsNUDXs的相对表达量
此外，NUDIX水解酶在植物生长过程中起着重要的协调作用[15]，亚细胞定位预测结果显示主要分布在细胞核、叶绿体、线粒体中，这与大豆（）的结果一致[14]，说明可能在细胞核、叶绿体和线粒体中发挥作用。玫瑰在花瓣中表达量最高，且花发育后期香气散发达到最大时表达量持续增加，而抑制的表达后玫瑰芳香物质合成减少[28]。玫瑰品种唐红中的表达量与花朵开放程度呈正相关，且主要芳香成分也随花朵开放程度增加而增加，在盛开期达到最高；
将转入矮牵牛（Vilm）中可显著增加矮牵牛的主要香气成分含量，且感官上可闻到浓郁香气，过表达也可显著增强矮牵牛花香的浓郁程度[29]。以上结果表明，家族基因的组织表达特异性与其功能具有较高的相关性。本研究发现，和在花中表达量较高而在其他组织部位中表达量极低，推测其主要在花中发挥作用。
本研究首次对全基因组进行了鉴定和表达模式分析，在43个的启动子区发现了许多与光响应、激素响应和逆境胁迫相关的作用元件，且在茶树各组织中均有表达，表明参与茶树的生长发育调控。此外，利用实时荧光定量PCR技术检测了9个在SA、MeJA和NaCl处理下的表达模式，发现其均可响应SA、MeJA和NaCl处理。综上所述，可以响应多种逆境胁迫，但在协调茶树生长发育和响应逆境胁迫过程中的具体机制仍需进一步探清。
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Identification and Expression Pattern Analysis ofGene Family in
CHEN Zhenyan1, ZHANG Xiangqin1, CHEN Lan1, XIE Siyi1, LIU Shuoqian1,2*, TIAN Na1,2*
1. Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Changsha 410128, China; 2. Department of tea science, College of horticulture, Hunan Agricultural university, Changsha 410128, China
NUDIX hydrolase belongs to pyrophosphatase, which plays an important role in information transmission, plant growth coordination and responses to adversity stresses. In this study, 43family genes were identified based on the tea () genome, and analyzed by bioinformatics and fluorescence quantitative PCR. The results show that the protein molecular weight of 43 CsNUDXs rang from 11.8～89.2 kDa, with 102 to 342 amino acids. The theoretical isoelectric point was from 4.49 to 9.26, and 18.6% of them were stable proteins. According to the evolutionary relationship,is divided into six subfamilies.-acting element analysis of promoter shows thathave many functional elements related to hormone response, adversity stress, growth and development. The expression patterns ofin different organs were analyzed. It was found that the expression levels ofandwere high in fruits, while the expression levels ofandwere extremely low in fruits, and the expression level ofwas extremely low in old leaves. In addition, the results of real-time fluorescence quantitative PCR show that the expression levels of, such as,andincreased first, then decreased and then increased under the treatment of 1 mmol·L-1MeJA. However, under the treatment of 1 mmol·L-1SA, the expression levels of,anddecreased first, then increased and then decreased. While under the treatment of 300 mmol·L-1NaCl, the expression levels of,andincreased first and then decreased. In summary, the basic characteristics and functions ofwere preliminarily analyzed by bioinformatics technology, and it was found thatcould respond to high salt stress, MeJA and SA treatments.
,gene family, abiotic stress, expression analysis
S571.1；
Q786
A
1000-369X(2023)02-159-14
2023-01-17
2023-03-04
国家自然科学基金（32172629）、湖南省种业创新项目（2021NK1008）
陈振艳，女，硕士研究生，主要从事茶树栽培育种及分子生物学方面研究。*通信作者：shuoqianliu@hunau.net；
tianna5678@163.com